Partie VII :
Annexes méthodologiques

VII.A. Galerie de spectres HSQC ¹H-¹⁵N

L’expérience 2D HSQC ¹H-¹⁵N (Bodenhausen et Ruben, 1980) permet de corréler chaque azote avec le ou les hydrogènes qui lui sont liés covalemment. Dans une protéine, chaque résidu est caractérisé par la liaison N–H de sa fonction amide, à l’exception des prolines (dont l’azote ne porte aucun hydrogène) et du résidu N-terminal (l’hydrogène de la fonction amine étant labile). Chacune des liaisons amides N–H d’une protéine enrichie en ¹⁵N donne lieu à un pic de corrélation sur le spectre HSQC ¹H-¹⁵N.

La position du pic dans le spectre est décrite par les déplacements chimiques du proton et de l’azote. Le déplacement chimique traduit le « blindage » d’un noyau par les électrons, s’opposant à l’établissement du champ magnétique. Il dépend de tous les facteurs qui peuvent modifier la structure ou la géométrie des orbitales moléculaires. Plusieurs interactions physiques interviennent dont les contributions ne sont pas encore toutes comprises ! L’interprétation du déplacement chimique reste donc essentiellement qualitative. On peut généralement distinguer (au moins pour la modélisation, cf. (Oldfield, 1995))

·      Les effets à courte portée : longueurs et angles de liaison (nature chimique du noyau), angles de torsion (d'ou l'interprétation des déplacements chimiques en termes de structure secondaire), liaisons hydrogène fortes...

·      Les effets à longue portée : contributions électrostatique (dipôles voisins) et magnétique (courant de cycle aromatique, anisotropie du carbonyle...). Ces interactions sont particulièrement sensibles à la structure tertiaire de la protéine et cette sensibilité est plus forte pour le proton que pour les autres noyaux.

Le spectre HSQC ¹H–¹⁵N constitue une empreinte de la protéine d’étude et de son état de repliement, d’où son utilisation fréquente dans les études de faisabilité en RMN (Yee et al., 2002). Le travail présenté ici sur le domaine C-terminal de la protéine TolA donne un aperçu des différentes situations rencontrées, récapitulées ci-dessous. Le lecteur de la version électronique de ce document est encouragé à fractionner sa fenêtre de travail afin de comparer de façon interactive les différents spectres. Le lecteur de la version imprimée pourra se référer aux sections mentionnées.

Tableau 8 : Galerie de spectres HSQC ¹H-¹⁵N de TolAIII à 27 °C (sauf 8)

Figure 32 : Spectre HSQC ¹H–¹⁵N de TolAIII2 (0,2 mM) dénaturé dans l’urée (8 M).   

VII.B. Principe de l’attribution séquentielle des résonances d’une protéine

VII.B.1. Chaîne principale de la protéine TolAIII2 enrichie en ¹⁵N

L’attribution séquentielle des résonances ¹H et ¹⁵N de la chaîne principale de la protéine TolAIII2 a été réalisée à partir des expériences 3D TOCSY-HSQC ¹H–¹⁵N et 3D NOESY-HSQC ¹H–¹⁵N (Marion et al., 1989), (Bodenhausen et Ruben, 1980).

L’ajout d'une troisième dimension ¹H à un spectre HSQC ¹H–¹⁵N (figure 33) permet de corréler chaque proton amide avec les protons qui appartiennent au même résidu (3D TOCSY-HSQC ¹H–¹⁵N) ou avec les protons les plus proches dans l'espace (3D NOESY-HSQC ¹H–¹⁵N).

Figure 33 : Représentation schématique d’un spectre 3D TOCSY-HSQC ¹H–¹⁵N
et de l’extraction des bandes correspondant aux systèmes de spin.

Un spectre tridimensionnel étant difficilement exploitable directement, nous en avons extrait pour chaque N–H peptidique repéré dans le spectre HSQC une “bande” dans la troisième dimension. La série de bandes ainsi extraite a été imprimée pour l’analyse (figure 33).

Le spectre 3D TOCSY-HSQC ¹H–¹⁵N permet l’identification des résidus. Des spins appartiennent au même système lorsqu'ils présentent entre eux des couplages scalaires. Les protéines ont cette particularité que les systèmes de spins ne franchissent pas les liaisons peptidiques (pas de couplage scalaire entre spins de résidus voisins). Tous les protons couplés[40] avec un proton amide donné appartiennent donc au même résidu. La topologie de ce système de spins (nombre et position des fréquences de résonance des protons) est une caractéristique qui permet d'identifier la nature des résidus en présence. Cependant, une dégénérescence certaine limite à ce niveau l’identification à des familles de résidus. En pratique, les familles suivantes ont été utilisées : (Gly), (Ala), (Ser), (Thr), (Val / Ile / Leu), (Glu / Gln / Met / Lys / Arg), (Cys / Asp / Asn / Phe / His / Trp / Tyr).

Une fois la nature du résidu identifiée pour chaque pic de l'HSQC ¹H–¹⁵N, il reste à déterminer de façon biunivoque sa place dans la séquence. Cette étape d’attribution est possible grâce au spectre 3D NOESY‑HSQC ¹H–¹⁵N. L’effet nucléaire Overhauser (NOE) diminue avec la distance entre les noyaux considérés. Il se manifeste particulièrement entre un proton amide et les protons des résidus voisins. L'exploitation du spectre NOESY‑HSQC ¹H–¹⁵N débute par sa comparaison avec le spectre TOCSY-HSQC ¹H–¹⁵N, ceci afin de repérer les pics de corrélation internes au résidu. L'identification des pics restants fournit l'information de voisinage entre résidus d'acides aminés. L'identification, même dégénérée, de la nature des résidus permet alors de retrouver leur emplacement dans la séquence (Wüthrich, 1986).

Avec cette méthode, la stratégie d’attribution dépend fortement des éléments de structure secondaire. L’attribution des hélices a repose sur les contacts NOE intenses entre protons amides de résidus voisins dans la séquence. Les contacts moins intenses entre proton amide et proton a du résidu précédent apporte en outre une information sur l’ordre des résidus (figure 34).

Figure 34 : Représentation des contacts NOE au sein de la première hélice a de TolAIII2(0,5 mM). Des bandes horizontales ont été extraites d’un spectre 3D NOESY–HSQC ¹H–¹⁵N à 27°C. Les résonances encadrées correspondent à celles du spectre 3D TOCSY–HSQC¹H–¹⁵N.

Les brins b sont eux reconnaissables à l'intensité des contacts NOE entre proton amide et proton a, ainsi qu'au déblindage significatif de certains protons a. La topologie des contacts NOE au sein d'un feuillet b est moins simple que pour une hélices a : bon nombre de contacts sont observés non entre résidus voisins dans la séquence, mais entre résidus de brins opposés. En outre, cette topologie est spécifique de la nature du feuillet b.

VII.B.2. Chaîne principale de la protéine TolAIII3 enrichie en ¹³C et ¹⁵N

Le marquage au ¹³C de la protéine accélère le travail d’attribution séquentielle des résonances car il donne accès à une plus grande variété d’expériences de RMN. Dans le cas de TolAIII3, j’ai enregistré un spectre HNCA en plus des spectres 3D TOCSY–HSQC ¹H–¹⁵N et 3D NOESY–HSQC ¹H–¹⁵N.

Les résidus d’acides aminés sont identifiés par leurs résonances H_N et N_H (spectre HSQC ¹H–¹⁵N). La nature de chaque résidu est déterminée (avec une certaine dégénérescence) grâce au spectre 3D TOCSY–HSQC ¹H–¹⁵N. Le voisinage entre résidus est déterminé grâce au spectre HNCA (Kay et al., 1990). Un tel spectre corrèle le H_N et le N_H d’un résidu avec le C_a propre au résidu et le C_a du résidu précédent dans la séquence. Il est donc possible de proche en proche, de connecter les systèmes de spin voisins dans la séquence. L’expérience HNCA présente plusieurs avantages par rapport à l’expérience 3D NOESY–HSQC ¹H–¹⁵N. D’abord, un spectre HNCA est facile d’interprétation puisqu’il comporte seulement deux pics sur chaque « bande ». Ensuite, comme les corrélations reposent sur des couplages scalaires[41] et non pas sur des couplages dipolaires[42], elles ne dépendent pas, en première approximation, de la structure de la molécule dans l’espace (en particulier les éléments de structure secondaire). Dans le cas où plusieurs C_a résonnent à la même fréquence, le recours au spectre 3D NOESY–HSQC ¹H–¹⁵N permet en général de lever l’ambiguïté grâce aux déplacements chimiques des H_a.

Comme précédemment, j’ai extrait une bande pour chaque N–H peptidique et la série de bandes a été imprimée pour l’analyse. Par ailleurs, l’attribution préalable des résonances de la chaîne principale de TolAIII2 a servi d’appui pour faciliter celle de TolAIII3.

L’attribution des résonances des carbonyles se fait finalement grâce à un spectre HNCO (Kay et al., 1990) à partir de l’attribution des résonances N–H. L’expérience HNCO corrèle le H_N et le N_H d’un résidu avec le CO du seul résidu précédent. Bien que l’on utilise le résidu adjacent pour l’attribution d’une résonance, cette expérience ne permet pas d’établir de connectivité entre résidus.

VII.B.3. Chaînes latérales de la protéine TolAIII3 enrichie en ¹³C et ¹⁵N

Un certain nombre d’expériences permettent de repérer les déplacements chimiques des carbones ou des protons de chaîne latérale à partir des résonances N_H et H_N du même résidu ou du résidu suivant dans la séquence.

Tableau 9 : Spectres tridimensionnels utilisés pour l’identification des résonances des chaînes latérales

A l’intérieur des systèmes de spin ainsi identifiés, l’attribution des résonances des carbones et des protons qui leur sont liés covalemment repose sur l’expérience 3D HC(C)H-TOCSY. Cette expérience cruciale corrèle un carbone aliphatique, le ou les proton(s) qui lui sont liés covalemment, et les autres protons du même système de spin. Par ailleurs, l’attribution s’appuie en grande partie sur les gammes de déplacements chimiques propres aux différents carbones et protons de la chaîne latérale, même si ces gammes peuvent se chevaucher largement (figure 35).

Cette étape de l’attribution s’effectue en visualisant sur un même écran d’ordinateur les coupes 2D de tous les spectres 3D ci-dessus, et en vérifiant les alignements à l’aide d’un curseur lié à tous les spectres. Le logiciel utilisé ici est FELIX (Accelrys) sur station Silicon Graphics.

A ce stade, l’attribution des résonances n’est pas stéréospécifique car rien ne permet de distinguer les substituants de même nature portés par un même carbone.

Figure 35 : Déplacements chimiques des ¹H et ¹³C des chaînes latérales.
Diagrammes extraits de (Cavanagh et al., 1996), 
en tenant compte des errata publiés sur le site-web du troisième auteur[43].

VII.C. Méthodologie de l'étude de la formation de complexes par RMN

La formation d’un complexe entre deux molécules A et B peut être décrite par l’équation-bilan suivante et caractérisée par une constante d’association K_a.

A  +  B    AB

Lorsque deux protéines entrent en liaison, la biologie structurale se donne pour objectif de décrire cette interaction au niveau moléculaire. Quelles sont les régions des protéines qui entrent en contact ? Les protéines sont-elles déformées par l’interaction ? Leur dynamique est-elle affectée ? Quels sont les paramètres thermodynamiques et cinétiques de l’interaction ?

La RMN liquide est bien adaptée à ce type d’études. En effet, les molécules d’intérêt se trouve en solution et il est relativement aisé d’effectuer un titrage de l’association. Il suffit pour cela d’ajouter des quantités croissantes d’une solution concentrée de B à une solution de A contenue dans le tube de RMN. Dans d’autres applications non abordées dans ce travail, la RMN permet également de cribler simultanément une banque de composés B_i pour tester si l’un d’entre eux interagit avec la molécule cible A.

VII.C.1. Distinction des partenaires

Une des limitations de la RMN étant l’encombrement des spectres, on évite généralement d’observer simultanément les protéines A et B. On préfère observer une seule protéine à la fois. Par exemple, on observera A et l’effet de B sur A. Il est alors indispensable lors de l’enregistrement des spectres de pouvoir distinguer[44] les signaux provenant de A et les signaux provenant de B. Ceci est rendu possible par un marquage différentiel des partenaires. L’équation précédente s’écrira alors (marquage de A) :

A^*  +  B    A^*B

Dans notre étude, le marquage différentiel est obtenu par enrichissement isotopique en ¹⁵N de la seule protéine A^*, la protéine B restant froide[45]. L’expérience HSQC ¹H–¹⁵N servant de base à l’analyse des interactions, les signaux enregistrés proviennent de la seule protéine A^*.

VII.C.2. Distinction des espèces libre et liée

Cependant, la protéine A^* peut être présente sous deux espèces : libre (A^*) ou liée (A^*B). Encore une fois, afin de simplifier l’analyse des spectres de RMN, on privilégiera des conditions d’études dans lesquelles soit A^* soit A^*B est majoritaire

La thermodynamique régit l’équilibre entre les différentes espèces en solution.

Soit x la concentration du complexe A^*B. Notons x = [A^*B].
Soit a la concentration totale de la protéine marquée A^*. Nous avons a = [A^*] + x
Soit b la concentration totale de la protéine B. Nous avons b = [B] + x
L’équilibre thermodynamique s’écrit alors
ou encore

Compte tenu de la faible sensibilité de la RMN, l’ordre de grandeur de a est d’environ 10^–3 M. Dans notre cas, la constante d’affinité K_a est forte, de l’ordre de 10⁶ M^–1. Par conséquent K_a^-1 est négligeable[46] devant (a + b). L’équation précédente se ramène alors à celle–ci :
qui se résout aisément pour ;
on obtient x = min(a,b).

Autrement dit, la réaction d’association est quasi-quantitative. Lors d’un titrage de A^* par B la concentration a est fixe[47] et la concentration b augmente. Au départ, en l’absence de B, nous avons [A^*B]=0 et [A^*] = a. Au cours du titrage, nous avons [A^*B] = b et [A^*] = a – b tant que b reste inférieur à a. Puis [A^*B] = a et [A^*] = 0. Nous sommes alors dans des conditions adaptées à l’étude du complexe A^*B.

Pour résumer, lors du titrage suivi par RMN d’une protéine A^* par un ligand B, dans le cas où la constante d’affinité est très supérieure à la concentration des protéines, le spectre initial (avant ajout de B) est caractéristique de la protéine A^* isolée et le spectre final (dès que la quantité totale de B atteint la quantité initiale de A^*), est caractéristique de la protéine A^* liée à B.

La cinétique d’échange entre les espèces libre et liée se reflète dans l’aspect des spectres intermédiaires.

VII.C.3. Phénoménologie cinétique

La cinétique d’échange peut être décrite par deux constantes de vitesse : une constante d’association k_a et une constante de dissociation k_d.

A^*  +  B    A^*B

L’évolution des concentrations s’écrit alors

A l’équilibre, ces dérivées sont nulles. On a donc a k_d[A^*B] = a k_a[A^*][B]. La quantité peut encore s’écrire k_d+k_a[B] et définit la constante d’échange notée k_éch.

Soit un spin donné de la protéine A^*. Ce spin est en échange entre l’environnement de la protéine A^* libre, dans lequel sa fréquence de résonance est Ω_A*, et l’environnement de la protéine A^* liée à B, dans lequel sa fréquence de résonance est Ω_A*B. La vitesse d’échange entre ces deux environnements est déterminante pour le type de signal de précession libre observé. Une description théorique complète des phénomènes d’échange chimique peut être trouvée dans (Palmer et al., 2001)

En situation d’échange lent, lorsque k_éch < | Ω_A* – Ω_A*B |, le signal de précession libre enregistré pour ce spin est la superposition des signaux dans les deux environnements. On observe deux pics aux fréquences de résonance Ω_A* et Ω_A*B. L’intensité des pics est proportionnelle aux concentrations respectives de A^* et de A^*B (figure 36f). Lors du titrage suivi par RMN de la protéine A^* par le ligand B, on voit apparaître les résonances de A^*B tandis que celles de A^* disparaissent progressivement.

En situation d’échange rapide, lorsque k_éch > | Ω_A* – Ω_A*B |, le signal de précession libre enregistré pour ce spin constitue un pic unique dont la fréquence de résonance est la moyenne des fréquences de résonance Ω_A* et Ω_A*B pondérée par les concentrations respectives de A^* et de A^*B (figure 36a). Lors du titrage suivi par RMN de la protéine A^* par le ligand B, on voit les résonances de A^* se déplacer progressivement vers celles de A^*B. Dans ces conditions, il est possible d’attribuer les résonances de A^*B à partir de l’attribution des résonances de A^*, en suivant le déplacement des pics.

En situation d’échange intermédiaire, lorsque k_éch ≈ | Ω_A* – Ω_A*B |, le signal de précession libre enregistré pour ce spin devient coalescent. Les pics sont larges à tel point qu’on les distingue faiblement du bruit de fond (figure 36c). En pratique, on observe donc une disparition des pics de résonance des spins en échange intermédiaire. Ces conditions rendent la poursuite de l’étude particulièrement difficile.

Figure 36 : Spectres de RMN 1D pour un spin en échange chimique entre deux environnements. De gauche à droite, les concentrations des composés A^* et A^*B sont dans des rapports 3:1, 3:3 et 1:3. De haut en bas, les constantes d’échanges k_éch sont de 10000 s^–1 (a), 2000 s^–1 (b), 900 s^–1 (c), 200 s^–1 (d), 20 s^–1 (e), 0 s^–1 (f).
Les simulations ont été calculées avec des vitesses de relaxation de 10 s^–1.
Figure adaptée de (Palmer et al., 2001)

VII.D. Calculs de structure de protéine par RMN avec attribution semi–automatique des contacts NOE

VII.D.1. Méthodes d’attribution semi-automatique des contacts NOE ambigus

Plusieurs approches pour automatiser le processus laborieux d’attribution des contacts NOE ont été proposées. Dans chacune d’elle, une liste de candidats à l’attribution d’un pic de corrélation ambigu est générée à partir de la position du pic de corrélation, de la liste des déplacements chimiques des protons de la protéine (la plus complète possible) et d’un paramètre définissant la largeur de la plage de déplacements chimiques admis. Ce paramètre permet de prendre en compte l’incertitude sur le déplacement chimique, due à la résolution limitée des spectres, à la forme imparfaite des pics et aux différences de conditions expérimentales (température, tampon) entre les enregistrements. Selon la qualité des données, il est souhaitable de réduire autant que possible cette tolérance car une large plage de déplacements chimiques admis augmente le niveau d’ambiguïté.

Le logiciel AutoStructure ((Greenfield et al., 2001)) adopte une approche de système expert, en implémentant les règles d’attribution utilisées par un spectroscopiste expérimenté. Les premières contraintes sont déterminées sur la base des éléments de structure secondaire (identifiés grâce aux déplacements chimiques), sur des considérations de symétrie[48] dans l’expérience 3D NOESY–HSQC, et sur la consultation de la carte des contacts attribués. Ce jeu initial de contraintes permet de calculer un premier modèle moléculaire à partir duquel d’autres contraintes peuvent être ajoutées de manière itérative. Les distances entre protons dans le modèle moléculaire permettent de lever certaines ambiguïtés. Les contraintes violées sont identifiées et réattribuées.

Dans l’approche de NOAH ((Mumenthaler et Braun, 1995), (Mumenthaler et al., 1997)), les candidats pour un même pic de corrélation sont traités comme autant de contraintes de distance indépendantes dans le calcul de structures. Les contraintes violées dans un grand nombre de structures sont ensuite éliminées pour le calcul de structures suivant. Le cycle est répété jusqu’à attribuer chaque pic de corrélation à une paire unique de protons. Le jeu initial de contraintes est limité aux pics de corrélations les moins ambigus.

Dans l’approche d’ARIA[49] ((Nilges et al., 1997), (Linge et al., 2001)), les candidats pour un même pic de corrélation sont traités comme une seule contrainte de distance (ambiguë) dans le calcul de structures. ARIA considère la contribution de chaque candidat au pic de corrélation, sans hypothèse a priori. Les candidats dont le pourcentage de contribution à l’intensité du pic de corrélation, d’après le modèle structural, est au-dessous d’un certain seuil sont ensuite écartés à chaque cycle, ce qui rend la contrainte de distance de plus en plus sélective. Les contraintes pour lesquelles le nombre de candidats dépassent un certain plafond d’ambiguïté ainsi que les contraintes violées systématiquement au-delà d’un certain seuil ne sont pas prises en compte. Le jeu initial de contraintes comprend la totalité des candidats (dans la limite du plafond d’ambiguïté maxn[50]).

D’autres approches fortement inspirées d’ARIA ont également été proposées, qui reposent elles aussi sur l’utilisation de contraintes de distances ambiguës.

L’approche de SANE[51] ((Duggan et al., 2001)) utilise une série de filtres dans la sélection des candidats à l’attribution d’un pic de corrélation ambigu. Outre leur contribution à l’intensité du pic de corrélation (critère relatif), les candidats peuvent aussi être écartés sur la base d’une distance entre protons trop élevée (critère absolu) dans le modèle précédent. Par ailleurs, certains candidats peuvent être éliminés en considérant les éléments de structure secondaire définis par l’utilisateur. Enfin, l’éventuelle attribution manuelle d’un pic de corrélation est considérée et permet d’éliminer les autres candidats ou d’alerter l’utilisateur si elle ne figure pas parmi les candidats. Dans cette approche, une large place est laissée à l’utilisateur pour contrôler le processus d’attribution.

L’approche du DIEP[52] (Gilquin et al., 1999), (Savarin et al., 2001) utilise un plafond d’ambiguïté et un seuil absolu de distance. L’élimination des autres candidats se fait sur la base de l’intensité relative de leur contribution au pic de corrélation. Contrairement à l’usage d’ARIA, la tolérance sur le déplacement chimique peut être définie pour chacune des itérations. On peut ainsi sélectionner lors des premières itérations les pics les plus faciles à attribuer (tolérance sur le déplacement chimique et seuil de distance faibles), puis élargir la portée des attributions possibles (tolérance sur le déplacement chimique et seuil de distance plus élevés).

Le logiciel CANDID[53] (Herrmann et al., 2002) reprend le concept de contrainte de distance ambiguë en utilisant une approche de système expert. Plusieurs règles participent au calcul d’un score permettant d’éliminer certains candidats. Ces critères sont : l’écart de déplacements chimiques entre le pic de corrélation et le déplacement chimique du candidat, la présence de pics symétriques, la compatibilité avec la structure covalente (pour les contraintes à courte portée), l’existence d’un réseau de contraintes associées et enfin la compatibilité avec les structures calculées précédemment. Afin de minimiser l’impact d’une erreur d’attribution, les contraintes à longue portées sont combinées (sans corrélation particulière), une contrainte combinée étant satisfaite si au moins l’une des contraintes individuelles est satisfaite.

VII.D.2. Principe de fonctionnement d’ARIA

Comme il est mentionné plus haut, le fonctionnement d’ARIA (Nilges et O'Donoghue, 1998),(Linge et al., 2001) repose sur la notion de contrainte de distance ambiguë. Cette approche considère tous les candidats pouvant contribuer à l’intensité du pic de corrélation.

Au cours du calcul de dynamique moléculaire, la contribution de chaque candidat est évaluée d’après les distances dans le modèle moléculaire déjà calculé. La somme de ces contributions est comparée au volume du pic de corrélation expérimental[54].

Une telle contrainte ambiguë est satisfaite si au moins un des candidats est compatible selon le modèle. Cette approche permet d’intégrer sans biais tous les candidats, sans que ceux qui ne contribuent pas au pic de corrélation soient connus a priori.

Comme l’information structurale contenue dans une contrainte ambiguë est plus faible que celle contenue dans une contrainte non-ambiguë, les candidats ayant les contributions les plus petites sont progressivement identifiés et éliminés au cours des itérations successives. Néanmoins, la combinaison de contraintes, même ambiguës, suffit à orienter le calcul vers la bonne structure, comme l’illustre l’analogie suivante tirée de (Linge et al., 2001). Si l’on sait qu’ARIA a été développé dans un pays germanophone, cette contrainte est ambiguë car il peut s’agir de l’Allemagne, de l’Autriche ou de la Suisse. Si l’on sait par ailleurs qu’ARIA a été développé dans un pays qui borde la mer, cette contrainte est elle aussi très ambiguë car beaucoup de pays le sont. Pourtant, la combinaison de ces deux informations ambiguës réduit les possibilités à un seul pays (l’Allemagne) qui satisfait à la fois les deux contraintes ambiguës.

ARIA traite indifféremment des pics de corrélation NOE explicites (attribués manuellement) ou des pics de corrélation NOE implicites (définis seulement par les déplacements chimiques de protons et de l’éventuel hétéroatome). L’implémentation locale d’ARIA a été modifiée (fichier NoeList.py) afin de traiter également les pics partiellement attribués[55] dans les expériences 3D NOESY-HSQC.

Chaque itération utilise la même liste de pics de corrélation. Seules les structures (de plus basse énergie) sont héritées d’une itération sur la suivante et affectent les étapes de calibrage et d’attribution automatique des pics.

Au début de chaque itération, chaque spectre est calibré indépendamment. Un spectre NOE est rétro-calculé à partir des meilleures structures de l’itération précédente et comparé au spectre expérimental afin de déterminer des constantes de calibrage (par types d’atomes). Les volumes expérimentaux des pics de corrélation sont alors traduits en contraintes de distance (éventuellement ambiguës). Les meilleures structures de l’itération précédente sont à nouveau analysées pour déterminer les contraintes violées systématiquement. Cette étape de calibrage est effectuée une première fois avec toutes les contraintes puis une seconde fois sans les contraintes violées[56]. Enfin, les bornes des contraintes violées sont élargies à l’intervalle [0 ; 6] Å et les contraintes toujours violées sont éliminées. Les violations sont définies par deux seuils de tolérance (en distance et en proportion sur l’ensemble structural) qui peuvent être paramétrés par l’utilisateur (paramètres violtoler et violratio).

L’étape suivante est l’attribution partielle des contraintes ambiguës. Les contraintes acceptées à ce stade sont analysées au regard des meilleures structures de l’itération précédente afin de déterminer la contribution de chaque paire de protons à l’intensité du pic de corrélation. Seules les contributions majoritaires sont conservées. Le paramètre ambigcutoff détermine la proportion des contributions conservées.

Après les étapes de calibrage et d’attribution, les contraintes des différents spectres NOESY sont écrites dans le répertoire de l’itération puis rassemblées (en éliminant les redondances) avant d’être intégrées aux autres contraintes (angles dièdres, liaisons hydrogène...) dans un calcul de dynamique moléculaire (recuit simulé) à partir des meilleures structures de l’itération précédente et de structures aléatoires. Les nouvelles structures calculées serviront de base à l’itération suivante.

VII.D.3. Guide d’utilisation d’ARIA

La liste de diffusion aria-discuss[57] rassemble les remarques des utilisateurs d’ARIA.

VII.D.3.a. Installation locale

ARIA est constitué d’une série de scripts Python et utilise CNSsolve (Brunger et al., 1998). Les fichiers nécessaires au bon fonctionnement d’ARIA version 1.0 ont été installés dans le répertoire /lx1/people/deprez/aria1.0/ .

ARIA requiert l’installation de CNSsolve (incluant les fonctions ARIA) et d’un interpréteur Python.

CNSsolve version 1.0 (http://cns.csb.yale.edu/v1.0/) a été compilé pour les stations SGI (répertoire /ric1/people/deprez/acns_solve_1.0/) et pour les stations Linux (répertoire /lx1/people/deprez/acns_solve_1.0/) en incluant les fonctions ARIA. Pour le bon fonctionnement de CNSsolve, les lignes suivantes doivent être incluses dans le fichier .cshrc de l’utilisateur :

if (( $HOST == 'rmnlx1' ) || ( $HOST == 'rmnlx2' )) then

setenv CNS_SOLVE '/lx1/people/deprez/acns_solve_1.0/'

else

setenv CNS_SOLVE '/ric1/people/deprez/acns_solve_1.0/'

endif

alias acns 'source $CNS_SOLVE/cns_solve_env; nice +15 cns_solve'

Des problèmes de calibrage de l’itération 0 sont rencontrés avec la version de CNSsolve compilée pour Linux (messages 99 et suivants de aria-discuss).

Un interpréteur Python (http://www.python.org) incluant le module Numeric a été installé dans le répertoire /usr/local/bin/ . Les lignes suivantes doivent être incluses dans le fichier .cshrc de l’utilisateur :

alias python '/usr/local/bin/python1.6'

setenv PYTHONPATH /lx1/people/deprez/aria1.0/

ARIA est lancé par la commande :

/usr/local/bin/python /lx1/people/deprez/aria1.0/Aria/RunAria.py

Si l’on veut pouvoir se délogger sans interrompre ARIA, on utilisera la commande :

nohup /usr/local/bin/python /lx1/people/deprez/aria1.0/Aria/RunAria.py >> ./run.out &

Il est utile de créer des raccourcis pour ces commandes dans le fichier .cshrc de l’utilisateur.

Les scripts CGI pour l’utilisation d’une interface graphique HTML ont été installés sur le serveur hamlet dans le répertoire /var/www/cgi-bin/aria/ . La page d’accueil est accessible à l’adresse suivante :

/lx1/people/deprez/aria1.0/html/aria.html .

J’ai créé dans le répertoire /lx1/people/deprez/aria1.0/perlscripts/ une série de scripts additionnels pour la préparation et l’analyse des données (Noehsqc_ppm_maker_n15.pl, Noehsqc_ppm_maker_c13.pl, Flx2List.pl, Bmrb2Talos.pl, Bmrb2seq.pl, Bmrb2ppm.pl, ADRanalysis.pl, ICount.pl, Tbl2Sheet.pl, PdbMmAlign2.pl, PdbRmsd.pl, DiscoAriaAlign.pl, energies.csh). L’utilisation de ces scripts est décrite plus loin. En l’absence de précisions supplémentaires, la lecture des données pour ces scripts se fait sur l’entrée standard et l’écriture des données se fait sur la sortie standard. Il est possible de rediriger ces deux flots grâce aux opérateurs UNIX ‘ < ‘ et ‘ > ‘ respectivement.

VII.D.3.b. Préparation des données pour ARIA

i) Contraintes de distances

Les spectres NOESY ont été analysés avec le logiciel FELIX (Accelrys Inc.).

Il est possible de préparer automatiquement une liste de pics de corrélation intrarésiduels et/ou séquentiels au format FELIX à partir de la table de déplacements chimiques au format STAR (BMRB) en utilisant le script PERL Noehsqc_ppm_maker_n15.pl pour l’expérience 3D NOESY–HSQC ¹H–¹⁵N (corrélations intrarésiduelles et séquentielles) et le script PERL Noehsqc_ppm_maker_c13.pl pour l’expérience 3D NOESY–HSQC ¹H–¹³C (corrélations intrarésiduelles).

Les listes de pics 3D au format FELIX peuvent ensuite être converties au format LIST utilisé par ARIA grâce au script PERL Flx2List.pl. On aura pris soin, pour les pics de corrélation attribués manuellement, de respecter la nomenclature IUPAC (figure 37) et la syntaxe suivante. Les contraintes dont les annotations incluent le caractère ‘ % ‘ ne sont pas prises en compte. L’annotation ‘null’ désigne un pic non attribué explicitement. Les éléments d’une attribution (type de résidu, numéro de résidu, nom d’atome dans cet ordre) sont séparés indifféremment par le caractère ‘ _ ‘ (underscore) ou le caractère ‘ : ’. Le type de résidu est optionnel, ainsi que le caractère H des protons autres que le proton amide. Plusieurs attributions peuvent être accolées. Il n’est pas nécessaire de répéter le numéro de résidu lorsque plusieurs atomes du même résidu participent à une attribution. Le caractère ‘ * ‘ peut être utilisé pour remplacer n’importe quel caractère. Ainsi, la nomenclature HD* désigne indifféremment les deux protons HD2 et HD3. Il est rappelé que l’implémentation de FELIX n’autorise pas plus de 16 caractères pour désigner une attribution. On réservera donc cette méthode aux pics de corrélations présentant un faible nombre de candidats. Voici quelques exemples de syntaxe correcte :

Figure 37 : Nomenclature atomique pour les résidus d’acides aminés, recommandée par l’Union Internationale de la Chimie Pure et Appliquée (IUPAC). Figure reproduite de (Markley et al., 1998)

Le script Flx2List.pl fait appel à un fichier vol.txt contenant les volumes de pics exportés depuis FELIX et un fichier seq.txt contenant la séquence peptidique (un résidu par ligne sous forme de trigramme en majuscules). Ces fichiers doivent être placés dans le répertoire courant. Le fichier seq.txt peut être créé avec Bmrb2seq.pl à partir de la table de déplacements chimiques au format STAR (BMRB).

La nomenclature atomique utilisée par le champ de force (issu de CHARMM) étant différente de celle utilisée dans la base de données de déplacements chimiques BMRB, une conversion est effectuée par le script Flx2List.pl. La correspondance entre les deux nomenclatures est indiquée ci-dessous (uniquement pour les nomenclatures des protons qui diffèrent).

Figure 38 : Différences de nomenclature entre la base de données de déplacements chimiques BMRB et le champ de force utilisé par ARIA pour les protons des résidus d’acides aminés.

La variable $WHICH_PEAKS en tête du script Flx2List.pl définit quel type de contraintes seront converties. La valeur “all“ entraîne la conversion des contraintes explicites et implicites. La valeur “allassi“ entraîne la conversion des contraintes explicites seulement.

ii) Contraintes diédrales

Le fichier d’entrée pour TALOS (Cornilescu et al., 1999) peut être créé à partir de la table de déplacements chimiques au format STAR (BMRB) en utilisant le script PERL Bmrb2Talos.pl. Ce script fait appel au fichier seq.txt placé dans le répertoire courant. Il effectue le changement de référence des déplacements chimiques pour passer du DSS au TSP.

Les données issues de TALOS peuvent être converties au format .tbl en utilisant le script awk talos_to_xplor.gawk fourni avec TALOS.

iii) Table de déplacements chimiques

La table de déplacements chimiques utilisée par ARIA peut être créée à partir de la table de déplacements chimiques au format STAR (BMRB) en utilisant le script PERL Bmrb2ppm.pl. Ce script opère la conversion de nomenclature des atomes évoquée précédemment.

VII.D.3.c. Déroulement du programme

L’utilisation d’ARIA comprend 4 étapes successives résumés sur la figure 39.

Figure 39 : Déroulement d’ARIA. Les extensions de fichiers correspondent aux types de données suivantes. seq : séquence peptidique ; list : contraintes de distances dans le format ARIA ; ppm : table de déplacements chimiques ; py : script Python ; tbl : contraintes expérimentales dans le format CNS ; cns : paramètres pour CNS ; psf : topologie moléculaire ; pdb : structure tridimensionnelle ; inp : script pour CNS ; out : journal de sortie de CNS

La première étape d’un calcul avec ARIA consiste à créer un fichier new.html . Ce fichier contient les informations nécessaires à la préparation des données (identifiant du calcul, chemins d’accès des principaux fichiers, largeurs des plages de déplacements chimiques admis, mode de pondération des contraintes de distances, etc.). Ce fichier peut être créé à partir d’un formulaire[58] HTML accessible à l’adresse suivante :

/lx1/people/deprez/aria1.0/html/aria.html. A l’usage, l’utilisateur constatera qu’il est plus rapide de modifier directement un fichier existant plutôt que de recréer un fichier ab initio.

La deuxième étape consiste à lancer ARIA dans le répertoire qui contient le fichier new.html . Ceci a pour effet d’établir l’arborescence pour le run[59] et de créer une copie locale des données (sous-répertoire data) et des protocoles (sous-répertoire protocols). L’archivage est ainsi assuré même si les données et protocoles originaux viennent à être modifiés ultérieurement. Les listes de contraintes de distances au format .list sont converties au format .tbl propre à CNS.

La troisième étape consiste à créer dans le répertoire du run un fichier run.cns. Ce fichier inclut tous les paramètres nécessaires au calcul itératif : types de contraintes, pont disulfure, spectres utilisés, matrice de relaxation, paramètres pour les itérations (maxn, violtoler, violratio, ambigcutoff...), protocoles de recuit simulé, etc. Un fichier run.cns par défaut a été créé lors de la deuxième étape. Ce fichier peut être édité à partir du formulaire HTML accessible à l’adresse :

/lx1/people/deprez/aria1.0/html/aria.html. Comme précédemment, l’utilisateur constatera qu’il est plus rapide de recopier et retoucher un fichier préexistant plutôt que de recréer un fichier ab initio.

La quatrième étape consiste à lancer ARIA dans le répertoire du run (celui qui contient le fichier run.cns ). Cela enchaîne les protocoles CNS sans autre intervention de l’utilisateur. Après les 8 itérations, les meilleures structures sont affinées dans une couche d’eau.

VII.D.3.d. Analyse des résultats

i) Analyse de l’attribution semi-automatique des contraintes de distance

Le script PERL ADRanalysis.pl permet l’analyse des contraintes de distance lors des étapes de calibrage et d’attribution d’une itération. Ce script doit être exécuté dans le sous-répertoire de l’itération avec comme arguments le nom du jeu de contraintes à analyser (généralement le nom du spectre dont il est issu) et le numéro de l’itération. Il apparaît alors de gauche à droite et pour chaque contrainte :

·      le statut initial de la contrainte (1=non-ambiguë acceptée, 2=non-ambiguë violée, 3=ambiguë acceptée, 4=ambiguë violée, 5=non-utilisée, 6=nouvelle)

·      le numéro de la contrainte dans la liste de pics

·      le niveau d’ambiguïté initial (‘-‘=implicite, 1=non-ambigu, 2=2 candidats, etc.)

·      ‘D’ pour un pic diagonal ou ‘ ? ‘ pour une erreur de sélection (pas de déplacement chimique dans la plage souhaitée)

·      ‘X’ si un problème a été rencontré avec la contrainte (examiner alors le journal de sortie du calibrage)

·      ‘%’ pour chacune des meilleures structures de l’itération précédentes pour laquelle la contrainte est violée (3 passages).

·      ‘X’ lorsque la contrainte est exclue

·      le statut final de la contrainte (1=non-ambiguë acceptée, 2=non-ambiguë violée, 3=ambiguë acceptée, 4=ambiguë violée, 5=non-utilisée, 6=nouvelle)

·      le numéro de la contrainte dans la liste de pics

·      le niveau d’ambiguïté après attribution (1=non-ambigu, 2=2 candidats, etc.)

·      ‘S...’ lorsque la contrainte est utilisée pour le calcul de structure.

Ce listage peut ensuite être filtré avec la commande UNIX grep pour des besoins statistiques. Le script PERL ICount.pl permet d’afficher à partir de ce listage l’histogramme des contraintes en fonction de leur niveau d’ambiguïté après attribution.

Le script PERL Tbl2Sheet.pl produit, à partir d’un fichier .tbl d’itération, une feuille de calcul permettant le décompte et la classification des contraintes à l’aide d’un tableur. Chaque atome impliqué dans une contrainte possède une entrée avec les informations suivantes : le numéro de la contrainte, le caractère non-ambigu (U) ou de stéréochimie flottante (S) ou ambigu (A) de la contrainte, le nom du résidu de l’atome, le numéro du résidu de l’atome, le nom de l’atome, le nom du résidu de l’atome partenaire, le numéro du résidu de l’atome partenaire, le nom de l’atome partenaire, la distance dans la séquence entre les deux résidus. Par symétrie, chaque contrainte apparaît donc en double et une variable booléenne est également créée permettant de filtrer les redondances.

ii) Analyse de l’ensemble structural calculé

Le script energies.csh affiche le listage des énergies (totale, de liaison, angulaire, diédrale, de van der Waals, NOE...) de chacune des structures calculées dans l’itération courante, par ordre d’énergie totale décroissante. Les noms des fichiers .pdb correspondants se trouvent dans les fichiers file.nam et file.list .

Le script PERL PdbMmAlign2.pl crée à partir de la liste de structures contenue dans le fichier file.nam une macro pour le logiciel MOLMOL (Koradi et al., 1996) permettant de générer un fichier molmolfit.pdb qui contient un alignement de l’ensemble structural. Ce fichier est utilisé par le script PERL PdbRmsd.pl pour calculer les écarts-types à la moyenne et les écarts-types croisés, calculés sur la position de la chaîne principale des résidus définis en tête de script.

Le script PERL DiscoAriaAlign.pl génère une macro pour le logiciel Insight (Accelrys Inc.) permettant d’afficher un alignement[60] des structures de meilleure énergie de l’itération. La variable $ENSEMBLE en tête de script définit le nombre de structures à aligner. La variable $SUBSEQ définit la zone d’alignement. La variable $ROOTNAME définit la racine de nommage des objets.

VII.E. Mode opératoire pour la préparation des échantillons de scones

Les échantillons de scones ont été préparés selon le mode opératoire suivant. 2,5 g de chlorure de sodium, 4 g de poudre à lever (tartre 60%; bicarbonate de sodium 25%; glucose polymérisé 15%) ont été mélangés à 200 g de poudre de gamètes femelles fécondés de Triticum aestivum (débarrassés de leur enveloppe). 50 g de résidu lipidique (battu en baratte) de sécrétion mammaire de Bos taurus ont été dissous manuellement dans ce mélange puis 25 g de saccharose ont été additionnés avant homogénéisation du fluide. 1 ovocyte de Gallus gallus (débarrassé de son enveloppe calcique et broyé à l'aide d'une tige métallique portant 4 pointes parallèles à son extrémité) et 0,2 L de sécrétion mammaire de Bos taurus ont été ajoutés. Le mélange a été pressé manuellement jusqu'à obtention d'un volume déformable non-adhérent, lequel a été adsorbé sur un plan horizontal sur une épaisseur de 0,015 m. Des disques ont été extraits à l'aide d'un cylindre évidé de diamètre 0,07 m. Ils ont été recouverts d'une couche mince uniforme de broyat d'ovocyte de Gallus gallus (vide supra) et disposés sur une plaque métallique lubrifiée (résidu lipidique battu en baratte de sécrétion mammaire de Bos taurus). Les échantillons ont été portés à une température de 473 K pendant une durée suffisante pour permettre un accroissement de volume d'un facteur 2 à 3 sans modification significative du spectre d'absorption de la surface ni dégagement de particules volatiles en quantités excessives, puis ils ont été laissés à température ambiante.

VII.F. A propos de ce document

La version originale de ce document a été rédigée avec Microsoft Word 98 pour Macintosh (http://www.microsoft.com/) dans le respect des styles décrits dans le « Guide pour la rédaction et la présentation des thèses à l’usage des doctorants » édité par le Ministère de l’Education Nationale et le Ministère de la Recherche en 2001 (téléchargeable à l’adresse http://www.sup.adc.education.fr/bib/Acti/These/guidoct.rtf). Les caractères soulignés constituent des liens hypertexte.

Les références bibliographiques ont été gérés avec ProCite 4 pour Macintosh (http://www.procite.com/).

Les figures ont été converties dans le format JPEG avec GraphicConverter pour Macintosh (http://www.lemkesoft.com/).

Les figures 10, 16 et 7, 8, 13b ont été construites sous UNIX respectivement avec MolScript (Kraulis, 1991) http://www.avatar.se/molscript/ et Raster 3D (Merritt et Bacon, 1997) http://www.bmsc.washington.edu/raster3d/raster3d.html, à partir des fichiers de coordonnées déposés dans la base de données Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb/index.html). La figure de couverture (représentation en saucisses) a été réalisée avec MOLMOL (Koradi et al., 1996) http://www.mol.biol.ethz.ch/wuthrich/software/molmol/ à partir de l’ensemble structural calculé dans la partie V.

Les articles joints au document sont dans le format PDF et peuvent être lus avec le logiciel Adobe Acrobat Reader (téléchargeable gratuitement sur le site de l’éditeur http://www.adobe.com/).