The TolA case
or
A Nuclear
Magnetic Resonance study of
the conformational metamorphoses of
the C-terminal domain of the Escherichia coli TolA protein
interacting with colicins and
the g3p bacteriophage capsid protein.
Abstract
The envelope of E. coli acts as a barrier against noxious agents (colicins, bacteriophages) which might enter the bacterium. Studying colicins has shed light on two protein systems allowing these agents to cross the outer membrane (translocation) : the TonB system and the Tol system. The function of the first one is to import siderophores and cobalamin actively into the periplasm. The role of the second one in maintaining the membrane integrity is rather unclear. Colicin A and phage M13 DNA translocation requires the binding to the C-terminal domain of the TolA protein (TolAIII) but this step is poorly understood yet.
In order to gain a new structural insight into this puzzle, we started the study of Escherichia coli TolAIII by Nuclear Magnetic Resonance.
First, we characterized three TolAIII samples and determined the 1H, 13C, 15N resonance assignments of one of them. Then we studied the interactions between TolAIII and its partners and put forward the following. Binding of TolB protein to TolAIII allows to map its interface on TolA. Binding of the N-terminal domain of colicin A to TolAIII induces tertiary structure alterations in TolAIII (increased flexibililty). Binding of the N-terminal domain of the phage capsid g3p protein to TolAIII induces severe alterations in the HSQC spectrum, which indicate conformational changes in TolAIII.
Eventually, we determined the solution three-dimensional structure of free E. coli TolAIII. To achieve this, we installed and adapted the semi-automated NOE assignment protocol ARIA. After this, we were able to compare the structure of free TolAIII with the previously determined crystallographic structure of TolAIII in complex with the N-terminal domain of g3p.
Résumé
L'enveloppe d'E. coli représente une barrière contre les agents nuisibles (colicines, bactériophages) qui tentent de s'introduire dans la bactérie. L'étude des colicines a mis en évidence deux système protéiques permettant le franchissement par ces agents de la membrane externe (translocation) : le système TonB et le système Tol. La fonction du premier est l'import actif des sidérophores et de la cobalamine. Le rôle du second dans le maintien de l'intégrité membranaire reste peu clair. La translocation de la colicine A et de l'ADN du bactériophage M13 implique une liaison avec le domaine C-terminal de la protéine TolA (TolAIII), mais reste mal comprise.
Afin d'apporter un nouvel éclairage structural à ce problème, nous avons entrepris l'étude par Résonance Magnétique Nucléaire du domaine TolAIII d'E. coli.
Pour permettre cette étude, nous avons caractérisé trois échantillons de TolAIII et déterminé l’attribution des résonances 1H, 13C, 15N de l’un d’eux. Nous avons étudié les interactions entre TolAIII et ses partenaires et mis en évidence les phénomènes suivants. L'étude de la liaison de TolAIII avec la protéine TolB du système Tol permet de localiser sa zone d'interaction sur TolA. La liaison de TolAIII avec le domaine N-terminal de la colicine A entraîne une altération de la structure tertiaire de TolAIII (flexibilité augmentée). La liaison du domaine N-terminal de la protéine d'enveloppe de phage g3p avec TolAIII fait apparaître des modifications importantes du spectre HSQC, laissant supposer des changements conformationnels de TolAIII importants.
Pour finir, nous avons déterminé la structure tridimensionnelle du domaine TolAIII d'E. coli isolé en solution. Pour cela, nous avons mis en place et adapté le protocole ARIA pour l'attribution semi-automatique des contacts NOE. Ce travail nous a permis de comparer le structure de TolAIII isolé et celle, déterminée précédemment par cristallographie, de TolAIII en complexe avec le domaine N-terminal de g3p.
Mots clés : Résonance Magnétique Nucléaire, système Tol/Pal, interactions protéine-protéine, colicine A, bactériophage, structure de protéine en solution, attribution automatique des NOE, ARIA
Discipline : Biologie Structurale et Fonctionnelle
Laboratoire de thèse : Institut de Biologie Structurale (UMR 5075). LRMN. 41, rue Jules Horowitz, 38027 Grenoble Cedex 1.
[1] la souche K12, non-pathogène
[2] contrairement au cytoplasme qui a un caractère réducteur.
[3] vitamine B12.
[4] chélatants du fer Fe3+.
[5] la phospholipase A.
[6] le groupe de phages filamenteux le mieux caractérisé biologiquement, composé des souches virales qui infectent les Escherichia coli à pilus F, notamment des souches virales fd, f1 et M13.
[7] On adjoint généralement à ces 19 colicines la cloacine DF13 (produite par Enterobacter cloacae) qui présente des caractéristiques très similaires à la colicine E3. La « colicine L » n’en est pas véritablement une puisqu’elle est produite par Serratia marcescens. Quant à la « colicine V », c’est en fait une microcine.
[8] Une revue a été consacrée à la colicine A ((Lazdunski et al., 1988)).
[9] Machinerie Sec.
[10] Cette activité est associée à la formation transitoire de canaux dans la membrane cytoplasmique, permettant l’accès de la toxine au cytoplasme bactérien (Mosbahi et al., 2002)
[11] comme tolérant
[12] Les protéines TonA (ou FhuA) et TonB tirent d’ailleurs leur nom de ce bactériophage (T one, en anglais).
[13] Etonnamment, des mutations dans les gènes tolC et tolZ peuvent conférer une tolérance à certaines colicines du groupe B (respectivement les colicines 5, 10 et les colicines Ia, Ib)
[14] sur 5500 testés parmi les 5570 gènes de Pseudomonas aeruginosa.
[15] communauté bactérienne entourée d’une matrice d’exopolysaccharides.
[16] aussi appelée ExbA
[17] 20 résidus de proline entre les résidus 57 et 102.
[18] Peptidoglycan associated lipoprotein
[19] l’interaction de TolB avec Lpp et OmpA étant Pal-dépendante (Clavel et al., 1998)
[20] D120N
[21] la délétion des résidus 337 à 376 ou 399 à 421 empêche la liaison de TolA avec les colicines A et E1 et provoque la tolérance de la bactérie pour ces colicines (Bénédetti et al., 1991).
[22] relaxation transversale
[23] étude structurale préliminaire effectuée par Pierre Broyer.
[24] dans la dimension 1H.
[25] Ces expériences, ainsi que la construction des plasmides et la production des domaines protéiques utilisés dans ce travail ont été faites par Roland Lloubès et Marthe Gavioli à l’Institut de Biologie Structurale et Microbiologie de Marseille. Elles sont décrites dans l’article publié dans Biochemistry (Deprez et al., 2002).
[26] après coupure du résidu de méthionine N-terminal
[27] ce phénomène est particulièrement fréquent pour les liaisons peptidiques qui précèdent les résidus de proline.
[28] dithiothréitol
[29] observée par « dot blot »
[30] bien que le périplasme, dans lequel se situe naturellement TolA, soit un milieu oxydant.
[31] Sauf mention contraire, les expériences de RMN ont été enregistrées à 27 °C.
[33] valeur mesurée pour un résidu de cystéine suivi par un résidu d’alanine, dans une pelote statistique.
* L’astérisque indique une protéine marquée par 15N. Le double astérisque indique une protéine marquée par 15N et 13C.
[34] conditions pour lesquelles TolAIII* libre n’est pas observable.
[35] L’utilisation de faibles volumes requiert l’utilisation de tubes à piston palliant les inhomogénéités de milieu au sein de l’aimant.
[36] par chromatographie d’affinité sur cobalt
[37] de séquence
AAHHHHHHRMRSSHAASSNKNASNDGSEGMLGAGTGMDANGGNGNMSSEE
QARLQMQQLQQNNIVYFDLDKYDIRSDFAQMLDAHANFLRSNPSYKVTVEGHADERGTPEYN
ISLGERRANAVKMYLQGKGVSADQISIVSYGKEKPAVLGHDEAAYSKNRRAVLVY
[38]
résidus résidus 44 à 142 suivis d’une
séquence polyhistidine : MEFEVDLPDATESQAVSSNDNPP
VIVEVSGIGQYTVVVEKDRLERLPPEQVVAEVSSRFKANPKVFLIGGAKDVPYDEIIKALNLLHSAGVKSVGLMTQPIKLAAALEHHHHHH
[39] identifiées à l’aide des NOE séquentiels et à moyenne distance
[40] directement ou indirectement
[41] couplages à travers les liaisons covalentes
[42] couplages à travers l’espace
[44] Notons que certaines techniques comme le dichroïsme circulaire n’offrent pas cette possibilité.
[45] c’est-à-dire non enrichie en isotope
[46] Lorsque Ka-1est du même ordre de grandeur que (a+b), l’approximation faite dans le texte n’est plus possible. En revanche, il devient possible de mesurer Ka à partir des données d’un titrage de A* par B (Coassolo et al., 1980).
[47] aux dilutions près dues à l’ajout de B concentré
[48] Par exemple, une corrélation entre (Ca,Ha) du résidu X et Hß du résidu Y est privilégiée si une corrélation symétrique entre (Cß,Hß) du résidu Y et Ha du résidu X est retrouvée dans le même spectre.
[49] ARIA : Ambiguous Restraints for Iterative Assignment.
[50] maxn=20 par défaut.
[51] SANE : Structure Assisted NOE Evaluation.
[52] DIEP : Département d’Ingénierie et d’Etude des Protéines, CEA-Saclay.
[53] CANDID : Combined automated NOE assignment and structure determination.
[54] La minimisation de la fonction d’énergie se fait en réalité dans l’espace des distances. Une distance effective (qui correspond à la distance hypothétique entre protons si une seule paire de protons contribuait au pic de corrélation) est estimée d’après le volume mesuré d’une part et est calculée d’après la modèle moléculaire d’autre part.
[55] Dans la version originale d’ARIA, une attribution manuelle est prise en compte seulement si elle est complète (dans toutes les dimensions). Lire à ce sujet le message 273 de la liste aria-discuss.
[56] Ainsi la calibration de l’itération initiale s’effectue sur les contraintes à courte portée.
[58] Par défaut, choisir le formulaire « ARIA .list format (uncalibrated data) ».
[59] Le terme « run » employé par ARIA désigne un calcul de structures itératif, ainsi que les fichiers et paramètres qui lui sont associés.
[60] sur la chaîne principale et par rapport à une structure cible définie par la variable $TARGET en tête de script.