Table des matières

Partie I : Contexte biologique.

I.A. Introduction.

I.B. L’enveloppe des bactéries à Gram négatif.

I.B.1. Structure de l’enveloppe.

I.B.2. Description de la membrane externe.

I.C. Bactériophages et colicines.

I.C.1. Les bactériophages filamenteux.

I.C.2. Les colicines.

I.D. Epistémologie de la translocation des colicines.

I.D.1. Génétique des anomalies fonctionnelles de membrane.

I.D.2. Classification des colicines suivant le mode de translocation.

I.D.3. Identification des gènes tol.

I.D.4. Analyse phylogénétique.

I.E. Le système TonB-ExbBD et le système Tol-Pal.

I.E.1. Le système TonB-ExbBD.

I.E.1.a. Structure du système TonB-ExbBD.

I.E.1.b. Fonction du système TonB-ExbBD.

I.E.1.c. Rôle dans la translocation des colicines et de l’ADN de bactériophage.

I.E.2. Le système Tol-Pal :.

I.E.2.a. Structure du système Tol-Pal.

I.E.2.b. Rôle du système Tol dans la translocation des colicines.

I.E.2.c. Rôle du système Tol dans la translocation de l’ADN de bactériophage.

I.E.2.d. Fonction du système Tol-Pal.

I.E.2.e. Eléments de similitude avec le système TonB-ExbBD.

Partie II : Problématique.

Partie III : Caractérisation des échantillons et attribution des résonances.

III.A. Définition de domaines et caractérisation des échantillons.

III.A.1. construction “ cytoplasmique longue ” TolAIII1.

III.A.2. construction “ cytoplasmique courte ” TolAIII2.

III.A.3. construction “ périplasmique courte ” TolAIII3.

III.B. Attribution séquentielle des résonances.

III.B.1. Chaîne principale de la protéine TolAIII2 enrichie en ¹⁵N.

III.B.2. Chaîne principale de la protéine TolAIII3 enrichie en ¹³C et ¹⁵N.

III.B.3. Chaînes latérales de la protéine TolAIII3 enrichie en ¹³C et ¹⁵N.

III.B.3.a. Note d’attribution.

Partie IV : Caractérisation des interactions de TolAIII avec ses partenaires.

IV.A. Liaison de TolAIII avec ATh et avec g3p N1.

IV.A.1. Résultats publiés.

IV.A.2. Résultats complémentaires :  possibilités d’étude du complexe TolAIII3*–ATh.

IV.B. Liaison de TolAIII avec des domaines de TolB, TolR et Pal.

IV.B.1. Liaison entre TolAIII et TolB.

IV.B.2. Essais de liaison entre TolAIII3 et Pal.

IV.B.3. Témoin négatif de liaison entre TolAIII3 et TolRII-III.

IV.C. Tableau récapitulatif des interactions étudiées par RMN entre TolAIII* et ses partenaires.

Partie V : Détermination de la structure du domaine TolAIII3 isolé en solution.

V.A. Etude de la structure de TolAIII seul en solution.

V.B. Calcul de la structure de TolAIII3 avec attribution semi-automatique des contacts NOE.

Partie VI : Conclusions et perspectives.

Partie VII : Annexes méthodologiques.

VII.A. Galerie de spectres HSQC ¹H-¹⁵N.

VII.B. Principe de l’attribution séquentielle des résonances d’une protéine.

VII.B.1. Chaîne principale de la protéine TolAIII2 enrichie en ¹⁵N.

VII.B.2. Chaîne principale de la protéine TolAIII3 enrichie en ¹³C et ¹⁵N.

VII.B.3. Chaînes latérales de la protéine TolAIII3 enrichie en ¹³C et ¹⁵N.

VII.C. Méthodologie de l'étude de la formation de complexes par RMN.

VII.C.1. Distinction des partenaires.

VII.C.2. Distinction des espèces libre et liée.

VII.C.3. Phénoménologie cinétique.

VII.D. Calculs de structure de protéine par RMN avec attribution semi–automatique des contacts NOE.

VII.D.1. Méthodes d’attribution semi-automatique des contacts NOE ambigus.

VII.D.2. Principe de fonctionnement d’ARIA.

VII.D.3. Guide d’utilisation d’ARIA.

VII.D.3.a. Installation locale.

VII.D.3.b. Préparation des données pour ARIA.

VII.D.3.c. Déroulement du programme.

VII.D.3.d. Analyse des résultats.

VII.F. A propos de ce document.

Partie VIII : Références bibliographiques.

Table des illustrations

Figure 1 : Structure de l’enveloppe des bactéries à Gram négatif.

Figure 2 : Représentation de la porine OmpF d’après modélisation moléculaire à partir de la structure cristallographique.

Figure 3 : Représentation du récepteur FecA en présence d’un ferrichrome, d’après la structure cristallographique..

Figure 4 : Structure de protéines de la membrane externe..

Figure 5 : Utilisation des bactériophages filamenteux pour l’identification de couples protéine-ligand..

Figure 6 : Structure cristallographique des domaines N1 et N2 de la protéine g3p.

Figure 7 : (a) Structure tridimensionnelle de la colicine Ia entière à une résolution de 3.00 Å. (b) Structure tridimensionnelle de la colicine E3 en complexe avec sa protéine d’immunité à une résolution de 3.02 Å. (c) Structure tridimensionnelle du domaine de fixation au récepteur et du domaine létal la colicine N à une résolution de 3.10 Å..

Figure 8 : Structure tridimensionnelle du domaine létal de la colicine A à une résolution de 2.4 Å..

Figure 9 : Organisation des opérons tol-pal..

Figure 10 : Structure cristallographique du dimère du domaine C-terminal de la protéine TonB (résidus 165 à 237)..

Figure 11 : Modèle de transduction d’énergie par l’intermédiaire de TonB..

Figure 12 : Structure du système Tol-Pal d’Escherichia coli..

Figure 13 : Structure cristallographique d’un dimère de Pal et de TolB..

Figure 14 : Modèle pour l’infection d’Escherichia coli par la colicine A..

Figure 15 : Modèle pour les étapes initiales de l’infection d’Escherichia coli par les bactériophages du groupe Ff..

Figure 16 : Structure cristallographique d’une protéine de fusion contenant le domaine N1 de g3p et le domaine TolA-III..

Figure 17 : Section ultrafine d’un mutant tolA mettant en évidence la formation de vésicules..

Figure 18 : Structure primaire des domaines TolAIII1, TolAIII2 et TolAIII3..

Figure 19 : Spectre HSQC ¹H–¹⁵N de TolAIII1 (0,1 mM).

Figure 20 : Spectre HSQC ¹H–¹⁵N de TolAIII2 (0,5 mM).

Figure 21 : Spectre de masse des fragments de protéolyse de TolAIII2 par l’endoprotéase LysC..

Figure 22 : Spectre HSQC ¹H–¹⁵N de TolAIII3 (0,1 mM).

Figure 23 : Spectre HSQC ¹H–¹⁵N attribué de la forme R de TolAIII2 (0,5 mM).

Figure 24 : Spectre HSQC ¹H–¹⁵N attribué de TolAIII3 (0,2 mM).

Figure 25 : Différences de déplacements chimiques dans les N–H de la chaîne principale entre TolAIII2 (forme R) et TolAIII3..

Figure 26 : Spectre HSQC ¹H–¹⁵N de TolAIII3 (0,1mM) libre et lié à ATh.

Figure 27 : Mesure de l’effet Overhauser hétéronucléaire {¹H}–¹⁵N pour la chaîne principale de TolAIII libre et TolAIII lié à ATh..

Figure 28 : Spectre HSQC ¹H-¹⁵N de TolAIII3 (0,1mM) libre et lié à g3p N1.

Figure 29 : Spectres HSQC ¹H–¹⁵N de TolAIII3* (0,5 mM) lié à ATh à 2 °C..

Figure 30 : Spectres HSQC ¹H–¹⁵N de TolAIII3* (0,5 mM)  lié à ATh à 57 °C..

Figure 31 : Spectre HSQC ¹H–¹⁵N de TolAIII1 (0,1 mM) libre et en présence de TolB à 27 °C, pH=6,8..

Figure 32 : Spectre HSQC ¹H–¹⁵N de TolAIII2 (0,2 mM) dénaturé dans l’urée (8 M)..

Figure 33 : Représentation schématique d’un spectre 3D TOCSY-HSQC ¹H–¹⁵N et de l’extraction des bandes correspondant aux systèmes de spin..

Figure 34 : Représentation des contacts NOE au sein de la première hélice a de TolAIII2 (0,5 mM)..

Figure 35 : Déplacements chimiques des ¹H et ¹³C des chaînes latérales..

Figure 36 : Spectres de RMN 1D pour un spin en échange chimique entre deux environnements..

Figure 37 : Nomenclature atomique pour les résidus d’acides aminés, recommandée par l’Union Internationale de la Chimie Pure et Appliquée (IUPAC)..

Figure 38 : Différences de nomenclature entre la base de données de déplacements chimiques BMRB et le champ de force utilisé par ARIA pour les protons des résidus d’acides aminés..

Figure 39 : Déroulement d’ARIA..

Table des tableaux

Tableau 1 : Action létale des différentes colicines..

Tableau 2 : Récepteurs d’E. coli parasités par les différentes colicines..

Tableau 3 : Protéines impliquées dans la translocation des colicines du groupe A.

Tableau 4 : Fragments de protéolyse de TolAIII2 par l’endoprotéase LysC.

Tableau 5 : Conditions biochimiques des échantillons de TolAIII2.

Tableau 6 : Attribution des résonances de TolAIII3 à 27 °C, pH=6,8..

Tableau 7 : Récapitulatif des interactions suivies par HSQC ¹H–¹⁵N entre les différentes constructions de TolAIII* et ses partenaires..

Tableau 8 : Galerie de spectres HSQC ¹H-¹⁵N de TolAIII.

Tableau 9 : Spectres tridimensionnels utilisés pour l’identification des résonances des chaînes latérales.